1. Uso deandrotec andrografólido 
Androtec unndrographolide es un inhibidor de NF-κB, que inhibe la activación de NF-κB a través de la modificación covalente de un residuo de cisteína en p50 en células endoteliales sin afectar la degradación de IκB o la translocación nuclear de p50/p65.
2.Actividad biológica de Andrographolide
In Vitro: Andrographolide (AP) suprime de forma dependiente de la concentración el activador del receptor del ligando kappa B del factor nuclear (RANKL) mediado por la diferenciación de osteoclastos y la resorción ósea in vitro y reduce la expresión de marcadores específicos de osteoclastos. Andrographolide atenúa la inflamación mediante la inhibición de la activación de NF-κB inducida por TNF a través de la modificación covalente de Cys62 reducido de p50, sin afectar la degradación de IκB o la translocación nuclear de p50/p65. Andrographolide también inhibe la vía de señalización de ERK/MAPK sin afectar la señalización de p38 o JNK. Andrographolide inhibe la diferenciación de osteoclastos de células RAW 264.7 de una manera dependiente de la concentración. Andrographolide suprime la formación de osteoclastos de una manera dependiente de la concentración sin efectos citotóxicos evidentes, tanto en BMM como en células RAW 264.7. El tratamiento con Andrographolide reduce sustancialmente el área de reabsorción ósea. Solo aproximadamente el 30 por ciento de la reabsorción ósea observada en el grupo de control se logra después del tratamiento con Andrographolide 2,5 μM. La resorción ósea osteoclástica se inhibe casi por completo después del tratamiento con Andrographolide 10 μM.
In Vivo: El tratamiento con Andrographolide (5 o 30 mg/kg) reduce el grado de pérdida ósea inducida por LPS. Además, Andrographolide aumenta ligeramente la DMO y el grosor de la corteza en comparación con el tratamiento con LPS. El examen histológico confirma los efectos protectores de Andrographolide sobre la pérdida ósea inducida por LPS. La inyección de LPS conduce a la erosión ósea inflamatoria y aumenta el número de osteoclastos positivos para TRAP.
Ensayo de quinasa: se realizan ensayos de osteoclastogénesis in vitro para examinar los efectos de Andrographolide en la diferenciación de osteoclastos. Se preparan células de macrófagos de médula ósea (BMM). Brevemente, las células extraídas del fémur y la tibia de un ratón C57/BL6 de {{0}}semana de edad se incuban en medio de cultivo celular completo y 30 ng/mL de M-CSF en un T-75 matraz de cm2 para proliferación. Al cambiar el medio, las células se lavan para eliminar las células estromales residuales. Después de alcanzar una confluencia del 90 por ciento, las células se lavan con PBS tres veces y se tripsinizan durante 30 min para recolectar BMM. Las células que se adhieren al fondo de la placa se clasifican como BMM; estos BMM se colocan en 96-placas de pocillos a una densidad de 8x103 células por pocillo por triplicado y se incuban en un incubador humidificado que contiene 5 % de CO2 a 37 grados durante 24 h. A continuación, las células se tratan con diversas concentraciones de Andrographolide (0, 2,5, 5 o 10 μM) más M-CSF (30 ng/mL) y RANKL (50 ng/mL). Después de 5 días, las células se fijan y se tiñen para determinar la actividad de la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP). Las células multinucleadas positivas para TRAP con más de cinco núcleos se cuentan como osteoclastos.
Ensayo celular: los efectos de Andrographolide sobre la proliferación celular se determinan con un CCK{{0}}. Los BMM se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 3x103 células por pocillo por triplicado. Veinticuatro horas más tarde, las células se tratan con concentraciones crecientes de Andrographolide (0, 2,5, 5, 10 o 20 μM) durante 2 días. A continuación, se añaden 10 μl de CCK-8 a cada pocillo y las placas se incuban a 37 grados durante 2 h más. A continuación, se mide la densidad óptica (DO) con un lector de microplacas de absorbancia ELX800 a una longitud de onda de 450 nm (referencia de 650 nm). Se calcula la viabilidad celular.
Administración de animales: ratones Los ratones C57BL/6 (8 semanas de edad) se dividen en cuatro grupos de siete ratones cada uno. A los ratones se les inyecta ip Andrographolide (5 o 30 mg/kg de peso corporal) o PBS como control 1 día antes de la inyección de LPS (5 ug/g de peso corporal). Andrographolide o PBS se inyecta por vía intraperitoneal cada dos días durante 8 días. El LPS se inyecta por vía intraperitoneal los días uno y cuatro. Todos los ratones se sacrifican 8 días después de la inyección inicial de LPS y los fémures izquierdos de todos los animales se escanean con una micro-CT de alta resolución a una resolución de 9 μm.
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